LC-MS/MS 단백질 전체 서열 검증
현대 의약 산업의 진보에 따라, 서열 분석은 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 백신류 생물의약품 분자 및 콜라겐 등 의료 기기류 제품의 연구 개발과 품질 관리에서 중요한 단계가 되었습니다. 단백질의 전 서열 검증 분석은 중요한 역할을 하며, 재조합 단백질 폴리펩타이드류 생물제제의 완전하고 정확한 표현을 확인하여 제품의 품질과 유효성을 보장할 수 있습니다.
백타이파크 바이오테크놀로지 BTP는 CNAS/ISO9001 이중 품질 인증 체계에 기반하여 단백질 시퀀싱 플랫폼을 구축하였으며, 이 플랫폼은 여러 대의 N단 서열 분석기, 초고효율 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기, 여러 번 최적화된 단백질 데 노보 시퀀싱 알고리즘 플랫폼을 갖추고 있습니다. 첨단 분석 장비와 알고리즘을 결합하여 BTP는 단백질의 전 서열 검증 분석을 수행할 수 있으며, 단백질의 완전성과 정확성을 보장하여 연구와 품질 관리 요구를 충족시킵니다.
액체 질량 연계 (LC-MS/MS) 단백질 전 서열 검증 분석:
단백질 전 서열 검증 분석의 일반적인 과정은 특이 단백질 분해효소를 사용하여 단백질 분자를 효소분해하여, 효소분해 후의 시험품은 복잡한 펩타이드 조성의 혼합물이며, 그 후 액체 질량 연계 플랫폼을 통해 시험품을 질량 분석합니다.
먼저, 샘플에 대한 전처리를 수행하여, 단백질 전장 이론 아미노산 서열과 질량 분석 수준 단백질 분해효소 절단 위치 정보를 결합하여 최소 다섯 가지 단백질 분해효소를 선택하여 단백질을 효소분해하여 효소분해 효율을 높여 더 높은 커버리지를 얻을 수 있도록 합니다. 실제 실험에서는 여러 단백질 분해효소(Trypsin, Chymotrypsin, Asp-N, Glu-C, Lys-C 및 Lys-N 등) 중 적합한 단백질 분해효소 또는 조합 효소분해 방식을 선택하여 타겟 단백질을 효소분해할 수 있습니다; 그 다음, 액체 질량 연계 Nano-LC-MS/MS 플랫폼을 사용하여 효소분해 후의 펩타이드 혼합물을 분석하여 총 이온 흐름 크로마토그래프와 질량 분석 원시 데이터를 얻습니다; 그런 다음, 측정된 단백질의 이론 서열을 기반으로 로컬 데이터베이스를 구축하고 전문 분석 소프트웨어를 통해 각 효소분해 후에 식별된 펩타이드를 매칭하고 계산합니다; 효소절단 위치 간의 상보성을 이용하여 단백질 서열을 조립하여 최종적으로 단백질 전 서열 검증을 실현합니다.
사례 도해:
항체 경쇄 전 서열 검증 분석 도해
일반적인 과정:
1、여러 단백질 분해효소 조합 효소분해 방식을 사용하여 단백질을 효소분해하여 효소분해 효율을 높이고 단백질의 각 아미노산의 서열 정보를 얻을 수 있도록 합니다.
2、Nano-LC-MS/MS 액체 질량 연계 고해상도 플랫폼을 사용하여 샘플을 분석합니다.
3、얻어진 질량 대 전하 비율 정보를 이론 서열로 구축된 데이터베이스와 비교합니다.
4、각 효소분해 방식으로 식별된 펩타이드를 조립하여 단백질이 완전하고 정확하게 표현되었는지에 대한 정보를 얻습니다.
실험 장비:
- 액체 크로마토그래프 (Easy-nLC1200)
- 전자 분무-조합형 사중극자-Orbitrap 질량 분석기 (Q Exactive™ HybridQuadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer )
응용:
- 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 백신, 콜라겐 등 생물제제의 아미노산 전 서열 검증 분석
- 단백질 번역 후 변형 및 화학적 변형 분석
- 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 백신, 콜라겐 등 생물제제의 아미노산 서열 돌연변이 분석
자주 묻는 질문:
질문1: 커버리지는 어떤 문제를 반영하나요? 커버리지가 100%가 되지 않을 경우 어떻게 해야 하나요?
답변:커버리지는 시퀀싱된 서열이 전체 서열 크기에서 차지하는 비율을 의미합니다. 이는 단백질에 대한 시퀀싱 결과의 커버리지를 반영하며, 만약 커버리지가 100%라면 샘플이 효소분해 처리 후 얻어진 서열이 목표 서열과 고도로 일치함을 나타냅니다. 만약 커버리지가 100%가 되지 않으면, 우리는 단백질 데이터와 서열을 검토하여 얼마나 많은 서열이 누락되었으며 이론적으로 어떤 펩타이드가 검출되지 않았는지를 확인합니다; 실제 결과를 바탕으로 기존 방법과 효소분해 처리를 계속 사용할지, 펩타이드가 누락된 위치를 새로 확보할지, 아니면 단백질 샘플 자체에 돌연변이가 발생하여 데 노보 시퀀싱 분석이 필요한지를 판단합니다.
질문2: 시퀀싱을 원하는 단백질의 분자량이 작을 경우 단백질 샘플 준비는 어떻게 해야 하나요?
답변:단백질의 분자량이 비교적 작을 경우, 고농도의 SDS-PAGE 젤을 사용하여 단백질을 분리한 후 단백질 젤을 코마시 브릴리언트 블루 염색을 하고, 목표 단백질 크기와 일치하는 단백질 밴드를 잘라낸 후, 잘라낸 단백질 젤 스트립을 질량 분석에 사용합니다.
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