C단 서열 분석
단백질은 여러 아미노산이 탈수 축합되어 배열된 구조로, 하나의 유리 아미노기(N 말단)와 하나의 유리 카복실기(C 말단)를 포함하고 있습니다. C 말단은 N 말단과 마찬가지로, 단백질 분자 구조 분석에서 중요한의지위로, 단백질 완전 1차 구조의 필수 정보이며, C 말단 서열을 측정하는 것은 중요한 의미를 가집니다.
베이징 바이타이파이크 생명공학 유한회사는 CNAS/ISO9001 이중 품질 인증 시스템을 기반으로, 펩타이드 지도 분석(질량 분석법) 원리에 따라, 다양한 종류의 생물제제에 대한 단백질 C 말단 서열 분석 서비스를 구축하여 단백질, 항체, 백신, 펩타이드,재조합콜라겐 등 생물제제의 C 말단 서열 측정을 실현할 수 있습니다.
기술 원리
현재까지 Edman 분해와 유사한 C 말단 서열 측정 기술은 개발되지 않았기 때문에, 단백질 C 말단 서열의 검증 서비스는 여전히 질량 분석 플랫폼을 기반으로 합니다. 목표 단백질 이론 서열 정보를 바탕으로 상보성이 좋은 두 가지 단백질 분해 효소를 선택하여 단백질을 절단하여, 두 가지 길이가 다른 하지만 이온화에 적합한 C 말단 펩타이드 조각을 생성하고, 질량 분석으로 검출하여 상호 검증 후 최종적으로 단백질 C 말단 서열을 확정합니다.
첨부된 일반적인 단백질 분해 효소 절단 조건 및 위치:
실험 기기
• 나노 리터 고효율 액체 크로마토그래피: Easy-nLC 1200;
• 조합형 사중극자-Orbitrap 질량 분석기: Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer.
사례 시사
샘플 단백질은 적절한 단백질 분해 효소로 절단된 후, 대부분이 6-28aa 길이의 펩타이드 조각으로 변환되어 질량 분석에 들어간 후 생성된 총 이온 흐름 그래프는 다음과 같습니다:
샘플 총 이온 흐름 그래프 (TIC)
(가로축은 시간(min), 세로축은 상대 신호 강도)
일차 질량 스펙트럼을 통해 전체 펩타이드 조각의 분자량을 얻을 수 있으며, mass=(m/z-1)*z
C 말단 펩타이드 조각 일차 질량 스펙트럼
(가로축은 검출된 m/z 값, 세로축은 상대 신호 강도)
이차 질량 스펙트럼으로 얻은 것은 펩타이드 조각의 파편 이온 m/z 값이며, 전체 펩타이드 조각은 질량 분석에서 펩타이드 결합 위치에서 파편 이온으로 분해되며, 펩타이드 조각의N 말단에 가까운 것은 b 이온이며, C 말단에 가까운 것은 y 이온입니다 (예: 이차 스펙트럼의 펩타이드 조각 KTSTSPLVKSF, 이차 분해 후, 파편 이온 K와 TSTSPLVKSF는 각각 b1과 y10 이온이고, 파편 이온 KT와 STSPLVKSF는 각각 b2와 y9 이온입니다). 이론적인 파편 이온 m/z와 실제 이차 스펙트럼에서 검출된 값이 많이 일치할수록 신뢰도가 높아집니다. 펩타이드 조각 이차 분해 조각 정보를 통해 C 말단 펩타이드 조각 서열을 확정합니다.
펩타이드 조각 이차 질량 스펙트럼
(가로축은 검출된 m/z 값, 세로축은 상대 신호 강도)
실제 프로젝트에서는 최소한 두 가지 상보적인 단백질 분해 효소를 사용하여 목표 단백질을 절단하여, 길이가 다른 두 개의 C 말단 펩타이드 조각을 얻을 수 있으며, 두 개의 C 말단 펩타이드 조각 서열의 상호 검증을 통해 최종적으로 단백질의 C 말단 서열 정보를 확정합니다.
일반적인전형적인문제
문제1: 단백질이 효소 절단 후 고정된 위치에서 분리되면, 어떻게 C 말단 펩타이드 조각이 단백질 C 말단인지 확인할 수 있습니까?
답변:데이터 분석 시 N 말단이 효소 절단 위치이고 C 말단이 효소 절단 위치가 아닌 펩타이드 조각을 선택하여, 펩타이드 조각이 효소 절단으로 형성된 것이며 무작위 불순물 펩타이드 조각이 아님을 보장하고, 펩타이드 조각 말단과 비교 말단이 일치하는 것을 보장합니다.
문제2: 분석 결과가 C 말단만 효소 절단 위치인 펩타이드 조각일 경우, C 말단의 구체적인 위치를 어떻게 추가로 확인할 수 있습니까?
답변:이러한 결과는 보통 두 가지 상황에 의해 발생합니다. 첫 번째 상황은 단백질의 C 말단이 효소 절단 위치에 딱 맞는 경우로, 우리는 다른 효소 절단을 동시에 분석하여 이 상황을 배제할 수 있습니다. 두 번째는 단백질 C 말단이 해당 효소 절단 위치에서 매우 가깝거나 멀리 떨어져 있으며, 절단 후 남은 조각이 너무 짧거나 길어 분해 상황이 너무 나빠 분석 소프트웨어에서 인식되지 않는 경우입니다. 우리는 각 서열이 이전 서열보다 아미노산이 하나 더 많은 그래디언트 데이터베이스를 구축하여 그래디언트 데이터베이스를 이용해 재분석할 수 있습니다.
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