정제된 단백질 생성물, 특히 단백질 제품의 분석 과정에서는 단백질의 말단을 확인하여 정제된 생성물의 N말단 및 C말단 서열이 정확한지 보장해야 합니다. Edman 분해법은 단백질의 N말단 서열 분석에서 성숙한 방법 중 하나로, 광범위하게 활용되고 있습니다. Biontapeck 회사는 Shimadzu사의 Edman 시퀀싱 시스템을 채택하여 많은 연구자와 연구 고객에게 정제된 단백질 생성물, 항체 및 단백질 백신의 N말단 시퀀싱 서비스를 제공합니다. 저희 시퀀싱 시스템을 사용하면 N말단 30개의 아미노산 서열 정보를 측정할 수 있습니다. 특정 단백질 로딩 시스템을 사용하면 N말단의 60-70개 아미노산을 측정할 수 있습니다. Biontapeck 회사는 또한 첨단 LC-MS/MS 기술을 사용하여 N-말단 시퀀싱 플랫폼을 구축하여 Edman 분해법과 보완하여 봉합되고 수정된 단백질 말단을 측정하고 N말단 시퀀싱 서비스가 원활하게 진행되도록 보장합니다.
단백질 시퀀싱 전에 먼저 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분리하여 샘플의 순도가 시퀀싱 요구 사항을 충족하도록 합니다. 그런 다음 SDS-PAGE의 단백질 샘플을 PVDF 막으로 전환합니다. 염색을 통해 단백질 밴드를 확인하고 잘라냅니다. Edman 시퀀서로 얻은 PVDF 막의 단백질 샘플을 분석합니다. Edman 분해 시퀀싱은 단백질의 N말단에서 시작하여 아미노산의 종류를 하나씩 확인하여 단백질의 N말단 서열을 측정하는 순환 반응을 통해 수행됩니다. 각 Edman 시퀀싱 반응은 세 단계로 이루어집니다. 첫 번째 단계는 알칼리 조건에서 PITC가 단백질 N말단의 자유 아미노와 결합하는 것입니다. 두 번째 단계는 산성 용액에서 N말단 잔기가 제거되는 것입니다. 세 번째 단계는 PITC 결합 잔기가 보다 안정적인 PTH 잔기로 변환되며, 온라인 HPLC 분석을 통해 용출 시간을 기반으로 아미노산의 종류를 확인합니다.
Edman 시퀀싱 반응 과정
Edman 분해 기반 단백질 N말단 시퀀싱 서비스 프로세스
Edman 시퀀싱 실험 절차도
응용 분야
•단백질 발현 생성물의 검증:재조합 단백질 삽입 위치 및 발현 순서가 올바른지 확인;
•세포주 확립 및 발효 과정에서의 단백질 생성물 검증:세포주 확립 및 발효 과정에서 단백질 생성물의 N말단 메티오닌 및 신호 펩타이드가 올바르게 처리되었는지 확인;
•단백질 분해/효소 절단 분석:분해/효소 절단으로 형성된 새로운 단백질 조각의 N말단을 분석하여 절단/효소 절단 위치를 확인;
•De-novo 시퀀싱:단백질 데이터베이스에 존재하지 않는 새로운 단백질 서열을 분석합니다.
샘플에 관하여
PVDF 막 샘플 준비 과정 1. 샘플 전기영동 및 전환
a. 단백질 샘플을 1D 또는 2D 젤에서 실행
b. 단백질 젤의 샘플을 PVDF 막으로 전환; 주의: 절대로 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membranes)을 사용하지 마십시오
c. 이 과정에서 반드시 장갑과 모자를 착용하여 자신의 케라틴이 시퀀싱 결과에 영향을 미치지 않도록 하십시오
2. PVDF 막의 염색
a. 염색 과정에서는 코마시 브릴리언트 블루 또는 리턴 레드를 사용하여 PVDF 막을 염색할 수 있습니다; 주의: 절대로 은염색 방법을 사용하지 마십시오
b. 염색 후에는 이중 증류수로 PVDF 막을 세척할 수 있습니다
c. 전환 버퍼에 글리신이 포함된 경우, PVDF 막을 여러 번 세척하여 글리신이 후속 분석에 미치는 영향을 방지해야 합니다
d. 보다 자세한 샘플 준비 단계는 Edman 시퀀싱 샘플 준비 프로토콜을 참조하십시오
3. 타겟 단백질 밴드 획득
a. PVDF 막을 염색한 후, 타겟 밴드가 명확히 보이면 깨끗한 해부용 칼로 타겟 단백질 밴드를 잘라냅니다
b. 단백질 양이 충분한 경우, 타겟 단백질 양을 증가시키기 위해 2-3개의 타겟 밴드를 준비할 수 있습니다
4. 샘플 운송
잘라낸 단백질 밴드를 밀봉 포장하고 아이스팩을 사용하여 운송합니다
용액 샘플 준비 과정 1. 단백질의 순도 및 사용량
a. 샘플은 1-10 ug 필요합니다
b. 샘플 순도는 90% 이상이어야 합니다
c. 버퍼에서 계면활성제를 사용하지 않으며, 가능한 한 용액의 염 농도를 낮춥니다
d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween 및 기타 계면활성제, ammonium sulfate 및 기타 암모늄 염은 후속 아미노산 식별에 영향을 미치므로 샘플 준비 과정에서 사용을 피해야 합니다
e. 샘플 준비 과정 전체에서 마스크와 모자를 착용하여 케라틴의 영향을 방지합니다
2. 단백질 샘플 운송
a. 액체 샘플은 드라이 아이스를 사용하여 운송하는 것이 좋습니다
b. 액체 샘플은 냉동 건조 또는 진공 건조 후 아이스팩을 사용하여 운송할 수도 있습니다
연구 사례
아래 그림과 같이 Edman 시퀀싱을 통해 식별된 아미노산의 상세 정보를 제공할 수 있습니다.
Edman 시퀀싱 연구 사례
중/영문 프로젝트 보고서
기술 보고서에서 Biontapeck은 귀하에게 상세한 중영문 이중 언어 기술 보고서를 제공하며, 보고서에는 다음이 포함됩니다:
1. 실험 절차 (중영문)
2. 관련 질량 분석 매개변수 (중영문)
3. 단백질 N말단 시퀀싱의 상세 정보
4. 질량 분석 이미지
5. 원시 데이터
