전사체 샘플 추출 단계는 무엇인가요?

전사체 샘플 추출의 핵심은 고품질 총 RNA의 추출과 품질 관리에 있으며, 전체 과정에서 RNA 분해를 방지하고 원래 전사체 발현 정보를 최대한 보존해야 합니다. 다음은 표준화된 단계입니다.

 

일. 샘플 준비

• 샘플 유형: 세포, 조직, 신선 또는 냉동 샘플일 수 있으며, 즉시 액체 질소로 급속 냉동하여 -80°C 또는 RNA 보호액에 보관하는 것이 좋습니다.

• 유의 사항: RNA 분해효소 오염을 전 과정에서 방지하고, DEPC 처리된 기구와 시약을 사용해야 합니다.

 

이. RNA 추출

일반적인 방법은 다음과 같습니다.

• TRIzol 방법(페놀/클로로포름 방법): 대부분의 조직 샘플에 적합하며, 추출 효율이 높습니다.

• 컬럼형 키트(예: Qiagen RNeasy): 조작이 간편하며, 대량 샘플 처리에 적합하고, 순도가 더 우수하나 수율이 약간 낮습니다.

단계 개요는 다음과 같습니다.

1. 세포/조직 용해: TRIzol 또는 용해액을 첨가하고 충분히 혼합합니다.

2. 상 분리: 클로로포름을 첨가하여 원심분리하여 층을 형성하고 수층을 취합니다.

3. RNA 침전: 이소프로판올을 첨가하여 원심분리하여 RNA를 회수합니다.

4. 세척 및 재현탁: 70–75% 에탄올로 세척한 후, RNA를 무핵산 분해효소 물로 재현탁합니다.

5. (선택 사항) gDNA 오염 제거: DNase I 처리(필수 권장).

 

삼. RNA 품질 관리

1. 농도 측정: NanoDrop 또는 Qubit, A260/280 ≈ 2.0, A260/230 ≥ 1.8 요구됨.

2. 완전성 평가: Agilent Bioanalyzer 또는 TapeStation을 사용하여 RIN 값(RNA 완전성 번호)을 측정합니다.

• RIN ≥ 7.0: 전사체 라이브러리 구축에 적합합니다.

• 3' 말단 시퀀싱에만 사용되는 경우, RIN ≥ 5도 허용됩니다.

• 샘플이 심하게 분해된 경우, polyA 농축 대신 rRNA 제거 방법을 고려할 수 있습니다.

 

사. 저장

• 단기(<1주): -80°C.

• 장기: RNA 안정액(예: Ambion RNAstable)을 첨가하거나 동결 건조 보관을 권장합니다.

 

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