다중 오믹스 분석 FAQ 요약
전사체 샘플 추출의 핵심은 고품질 총RNA의 추출 및 품질 관리에 있으며, 전체 과정에서 RNA 분해를 피하고 가능한 한 원래 전사체 발현 정보를 유지해야 합니다. 다음은 표준화된 단계입니다: 1. 샘플 준비 샘플 유형: 세포, 조직, 신선 또는 냉동 샘플이 될 수 있으며, 액체 질소로 즉시 동결하고 -80°C 또는 RNA 보호액에 보관하는 것이 좋습니다. 주의사항: 전 과정에서 RNase 오염을 피하고 DEPC 처리된 기구 및 시약을 사용해야 합니다. 2. RNA 추출 일반적인 방법은 다음과 같습니다: TRIzol 방법 (페놀/클로로포름 방법): 대부분의 조직 샘플에 적합하며, 추출 효율이 높습니다; 칼럼형 키트 (예: Qiagen RNeasy): 조작이 간편하고 고처리량 샘플 처리에 적합하며, 순도가 더 높지만 수확량은 약간 낮습니다. 단계 개요는 다음과 같습니다: 1. 세포/조직 용해: TRIzol 또는 용해액을 추가하고 충분히 호균화합니다. 2. 상 분리: 클로로포름을 추가하고 원심분리하여 층을 나누고, 수상층을 취합니다. 3. RNA 침전: 이소프로판올을 추가하고 RNA를 회수하기 위해 원심분리합니다. 4. 세척 및 재현탁: 70-75% 에탄올로 세척한 후, RNA를 무핵산수로 재현탁합니다. 5. (선택 사항) gDNA 오염 제거: DNase I 처리 (권장). 3. RNA 품질 관리 1. 농도 측정: NanoDrop 또는 Qubit을 사용하여 A260/280 ≈ 2.0, A260/230 ≥ 1.8을 요구합니다. 2. 완전성 평가: Agilent Bioanalyzer 또는 TapeStation을 사용하여 RIN 값을 측정합니다.......
• 리치 과피를 전사체에 보내려면 얼마의 g이 필요합니까?
전사체 시퀀싱에 필요한 샘플 양은 주로 샘플 자체의 RNA 함량과 추출 효율에 따라 다릅니다. 식물 조직(예: 리치 과피)의 경우, 일반적으로 권장하는 바는: 각 샘플에 대해 0.5–1 g의 신선한 조직을 준비하는 것입니다. 샘플의 수분 함량이 높거나 RNA 함량이 낮은 경우 1–2 g으로 적절히 증가할 수 있습니다. 샘플이 이미 분쇄된 액체 질소로 분쇄된 분말인 경우, 약 0.5 g이 일반적으로 충분하지만, 전제 조건은 고르게 분쇄되고 분해되지 않아야 합니다. 가능하면 즉시 액체 질소로 급속 동결하고 충분히 분쇄하며 RNA 분해를 피하는 것이 좋습니다. 샘플은 분리 포장하여 동결 보관 및 운송(드라이 아이스 또는 액체 질소)할 수 있습니다. 여러 번 반복하거나 여러 시간 지점을 계획하고 있다면, 각 샘플을 독립적으로 측정하여 보관하고 혼합 샘플을 피하는 것이 좋습니다.
전사체 시퀀싱(RNA-Seq) 결과가 돌아온 후, 분석 단계는 일반적으로 다음의 주요环节을 포함하며, 각环节마다 특정 처리 방법과 소프트웨어 도구가 있습니다: 일, 데이터 품질 관리 1, FastQC 분석: FastQC와 같은 도구를 사용하여 원시 데이터를 품질 관리하고, 시퀀싱 데이터의 품질을 평가합니다. 예를 들어, 염기 품질 점수, GC 함량, 서열 길이 분포 등이 있습니다. 2, 데이터 잘라내기: Trimmomatic 또는 Cutadapt와 같은 도구를 사용하여 저품질 서열, 어댑터 서열 및 너무 짧은 리드를 제거하여 후속 분석의 정확성을 보장합니다. 이, 서열 정렬 1, 정렬 소프트웨어 선택: 일반적으로 사용되는 정렬 도구에는 HISAT2, STAR 등이 있으며, 처리된 리드를 참조 유전체 또는 전사체에 정렬합니다. 정렬 선택은 시퀀싱 플랫폼, 종 및 유전체의 복잡성에 따라 다릅니다. 2, 정렬 비율 평가: 정렬 비율을 확인하여 시퀀싱 데이터의 품질과 참조 유전체의 적합성을 판단합니다. 일반적으로 고품질 RNA-Seq 실험은 높은 정렬 비율(>70%)을 가져야 합니다. 삼, 전사본 조립 및 정량 1, StringTie 또는 Cufflinks: 전사본 조립이 필요한 경우, StringTie 또는 Cufflinks와 같은 도구를 사용하여 정렬 결과에 대해 전사본 조립을 수행하고 새로운 전사본이나 새로운 유전자를 식별합니다. 2, 유전자 발현 정량: HTSeq, FeatureCounts, Salmon 또는 Kall 등을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다.
• 단백질 군과 전사체 군의 통합 분석 후, 두 군에서 공통으로 상향 조절된 유전자는 3개뿐이며, 공통으로 하향 조절된 유전자는 하나도 없습니다. 그 이유는 무엇일까요?
단백질체학과 전사체학의 통합 분석에서, 3개의 유전자가 공통으로 상향 조절되고 하향 조절된 유전자는 없는 현상이 발견되었습니다. 이는 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다: 첫째, 전사와 번역의 조절 차이 1. 전사 수준과 번역 수준의 차이 전사체 분석은 mRNA 수준을 다루고, 단백질체 분석은 단백질 수준을 다루므로, 두 경우가 항상 일치하지는 않습니다. mRNA의 안정성, 번역 효율, 단백질의 분해 속도가 최종 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 2. 번역 후 조절 mRNA 번역 과정에서 miRNA와 같은 요인에 의해 조절을 받을 수 있으며, 이는 단백질의 농도에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 기술 감도의 차이와 데이터 분석 방법의 차이 1. 기술 감도 차이 전사체학 기술(RNA-Seq 등)은 낮은 농도의 mRNA를 검출할 수 있지만, 질량 분석은 낮은 농도의 단백질 검출에 어려움을 겪어 특정 유전자가 mRNA 수준에서 상향 조절되었지만 단백질 수준에서는 뚜렷하게 나타나지 않을 수 있습니다. 2. 데이터 분석 방법의 차이 통합 분석을 수행할 때, 서로 다른 분석 방법(표준화, 필터 기준, 통계적 유의성 기준 등)이 서로 다른 결과를 초래할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질체와 전사체 데이터에서 서로 다른 차별 발현 선택 기준(예: p값, Fold change)을 사용하면, 공통으로 상향 조절되거나 하향 조절된 유전자의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 셋째, 생물학적 과정에서의 시간 차이 전사와 번역 사이에 시간 지연이 존재하며, 특정 유전자는 mRNA 수준에서 빠르게 상향 조절되지만 단백질의 변화는 시간이 필요할 수 있으므로 특정 시간 지점에서 하향 조절된 유전자를 관찰하지 못할 수 있습니다. ...
• 일반 전사체 시퀀싱 샘플 품질 검사가 불합격인 경우, 이 샘플을 다시 보낼 수 있습니까? 이전에 합격한 샘플과 함께 분석할 수 있습니까?
일반 전사체 시퀀싱 중 일부 샘플의 품질 검사가 불합격인 경우, 이러한 샘플을 개별적으로 다시 보낼 수 있습니다. 재전송된 샘플은 기술 프로세스와 데이터 분석에서 이전에 합격한 샘플과 통합 분석할 수 있지만, 데이터 품질 일관성을 보장하기 위해 다음 사항에 유의해야 합니다:
• 대변 샘플을 바로 원심분리관에 넣어도 되나요? 운송 시 다른 액체를 추가해야 하나요?
대변 샘플의 채취 및 운송 방식은 후속 실험 유형에 따라 엄격하게 결정되어야 합니다. 미생물 군집 연구에는 미생물 DNA를 안정화시키기 위해 전용 보존액 사용을 권장합니다; 대사체학에서는 어떤 보존액도 피하고 급속 동결 방식으로 대사물의 원형을 유지해야 합니다; 전사체 분석에는 RNA 분해를 방지하기 위해 RNA 보호액 또는 빠른 냉동을 추가해야 합니다. 운송 과정에서는 저온 체인이 완전하고 샘플 포장이 규격에 맞도록 하여 하류 실험 데이터의 정확성과 재현성을 보장해야 하며, 적절한 보존 전략을 선택하는 것이 고품질 연구 결과를 보장하는 핵심 단계입니다.
• 유산균 대사산물이 병원균에 미치는 작용 분석, 대사물 중에는 세포외 다당류, 단백질, 유기산 등이 있으며, 대사체학, 단백질체학 또는 기타 방법을 사용하여 분석해야 합니까?
유산균 대사산물이 병원균에 미치는 작용을 분석할 때, 대사물의 종류가 다양하여 세포외 다당류, 단백질, 유기산 등이 포함되므로 대사체학, 당체학 및 단백질체학을 종합적으로 활용해야 합니다. 대사체학은 소분자 대사물의 검출에 적합하며; 당체학은 세포외 다당류와 같은 대분자를 전문적으로 연구하며; 단백질체학은 항균 단백질 및 기타 기능성 단백질을 분석합니다. 따라서 다중 오믹스 종합 분석을 사용하는 것이 포괄적인 결과를 얻는 최상의 전략입니다.
• 무참조 전사체에 외온 위치를 포함하는 특정 유전자 정보가 있는 파일이 있습니까? 프라이머를 설계하는 데 사용할 수 있는 그런 파일이요?
무참조 전사체(De novo Transcriptome Assembly)는 참조 유전체가 없기 때문에 유전자의 외온 위치 정보를 직접 제공할 수 없습니다. 그러나 유전자 정보의 가용성은 후속 분석 단계에 따라 달라집니다. 다음은 프라이머 설계 정보가 포함될 수 있는 몇 가지 파일입니다:
동결 건조된 샘플에서는 RNA를 추출할 수 있지만, 추출 과정에서 몇 가지 문제에 주의해야 합니다. 동결 건조(lyophilization) 과정은 일반적으로 샘플 내의 수분을 제거하는데, 이는 세포 구조와 RNA의 완전성에 일정한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 RNA를 추출할 때는 특히 주의하여 RNA의 품질이 손상되지 않도록 해야 합니다.
전사체 분석에서 적절한 참조 유전체를 선택하는 것은 결과의 신뢰성과 생물학적 의미에 매우 중요합니다. 정렬율이 60%에 불과하다는 것은 다음과 같은 문제가 있을 수 있음을 나타냅니다:
How to order?
