C57 신생 태鼠의 대변에서 담즙산 스펙트럼의 성분과 함량을 어떻게 정성 및 정량 분석할 수 있을까요?
C57 신생 태아 쥐의 대변에서 담즙산 스펙트럼을 정성 및 정량 분석하기 위해 다음의 핵심 기술 문제를 해결해야 합니다: 샘플 매트릭스 복잡성, 다양한 유형의 담즙산과 극성 차이, 매우 낮을 수 있는 함량. 다음은 권장 실험 절차 및 방법입니다:
1. 샘플 전처리
1. 대변 수집
(1) 수집 시간: 신생 쥐의 장에서 처음 배설된 후 즉시 수집하여 모체 성분 오염을 피합니다.
(2) 보존 방법: 즉시 액체 질소로 급속 냉동하고, -80°C에서 장기 보존하여 담즙산 분해를 방지합니다.
2. 담즙산 추출
(1) 샘플 무게 측정: 동결 건조 후 대변을 정확하게 10–50 mg 측정합니다.
(2) 추출 용매: 냉각된 70% 메탄올(0.1% 폼산 포함) 또는 75% 아세토니트릴/물 혼합물을 1:20~1:40의 비율로 추가합니다.
(3) 내부 표준 추가: 안정 동위 원소로 표시된 담즙산 내부 표준(d4-CA, d4-CDCA, d4-DCA 등)을 추가하여 이후 정량 분석에 사용합니다.
(4) 초음파 진동 + 혼합: 얼음 목욕 초음파 15–30분, 4°C에서 원심분리합니다.
(5) 상청액 여과: 0.22 μm 필터를 사용하여 처리하고, 주입 병으로 옮깁니다.
2. 크로마토그래피-질량 분석 플랫폼 선택
UPLC-MS/MS 플랫폼을 사용하고, MRM 모드를 활용하여 고감도 정량 분석을 수행하는 것을 권장합니다.
1. 크로마토그래피 조건(추천)
(1) 크로마토그래피 컬럼: C18 역상 컬럼(Waters Acquity UPLC BEH C18, 1.7 μm, 2.1×100 mm)
(2) 이동상:
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A: 0.1% 폼산 물 용액
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B: 0.1% 폼산 아세토니트릴
(3) 그라디언트 용리: 담즙산 분리를 위한 적합한 그라디언트를 설정합니다(예: 30분 내에 20% B에서 95% B로 증가).
(4) 흐름 속도: 0.3 mL/min
(5) 컬럼 온도: 40°C
(6) 주입량: 5 μL
2. 질량 분석 조건(삼중 사중극 예)
(1) 이온화 방식: 음이온 모드(ESI-)
(2) 모니터링 방식: MRM(다중 반응 모니터링)
(3) 매개변수 최적화: 각 담즙산(결합형 및 자유형 포함)에 대해 분열 전압 및 충돌 에너지를 최적화합니다.
3. 데이터 처리 및 정량 방식
1. 표준품 정량
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Sigma 또는 Cayman과 같은 상용 담즙산 표준품을 사용하여 농도 그라디언트 표준 곡선을 만듭니다.
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각 담즙산은 독립적인 정량 채널을 설정하여 내부 표준과 결합하여 매트릭스 효과 및 손실을 보정합니다.
2. 데이터 분석
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MassLynx, Analyst 또는 Xcalibur와 같은 소프트웨어를 사용하여 MRM 피크 면적을 추출합니다.
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알려지지 않은 샘플의 피크 면적을 표준 곡선과 비교하여 농도를 계산합니다(단위는 대변 건조 중량당 ng/mg일 수 있음).
4. 분석 가능한 목표물
일반적인 담즙산 검출 항목에는 다음이 포함됩니다:
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초급 담즙산: CA(콜산), CDCA(케노데옥시콜산)
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차급 담즙산: DCA(데옥시콜산), LCA(리토콜산), UDCA(우르소데옥시콜산)
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결합형 담즙산: TCA, GCA, TCDCA, GCDCA 등
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