약물 추가 여부에 따른 이량체 함량을 어떻게 판단하나요?
약물 추가 및 비추가 조건에서 이합체 함량을 정확히 비교하려면 다음 사항을 명확히 해야 합니다: 단백질 특성(용해 가능 여부, 응집 여부), 검사 환경(체외 정제된 단백질 또는 세포/조직 용해액), 목표가 정성 분석인지 정량 분석인지 여부. 일반적으로 다음 전략을 고려할 수 있습니다:
1. 젤 전기영동 결합 정량
1. 원리:비환원, 저변성 조건에서 이합체가 단량체에 비해 구조적 차이를 유지할 수 있습니다.
2. 방법:
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비환원 SDS-PAGE 또는 Native-PAGE를 사용하여 분리합니다;
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염색 후 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 단량체 및 이합체 밴드를 그레이스케일로 적분하여 이합체 비율을 계산합니다;
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샘플 로딩 양이 선형 범위 내에 있어야 하며, 응집이나 과도한 로딩으로 인한 가양성을 피해야 합니다.
3. 적용성:간단하고 직관적이지만, 약한 결합 또는 동적 평형 상태의 이합체에 대해 과소 평가할 수 있습니다.
2. SEC (크기배제크로마토그래피)/HPLC
1. 원리:분자량에 따라 분리되어 단량체 및 이합체 피크를 구분할 수 있습니다.
2. 방법:
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표준 곡선(외부 표준 단백질 또는 알려진 농도의 정제된 목표 단백질)을 통해 피크 면적을 정량화합니다;
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정확성을 높이기 위해 MALS (다각도 광산란) 또는 UV 검출과 결합할 것을 권장합니다.
3. 적용성:더 정확한 비율을 제공할 수 있으며, 약물 유도 이합체 전환을 감지할 수 있습니다.
3. 교차결합 질량분석 (Crosslinking-MS) 또는 화학적 교차결합 + Western
1. 원리:약물이 이합체 동적 상태를 변경할 수 있으며, 교차결합을 통해 특정 이합체를 감지할 수 있습니다.
2. 방법:
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온화한 교차결합제(예: DSS, BS3)를 사용하여 상호작용을 고정합니다;
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SDS-PAGE 또는 질량분석과 결합하여 교차결합 생성물 비율을 분석합니다.
3. 적용성:단기 또는 저친화력 이합체에 적합하지만, 교차결합 조건을 엄격히 최적화해야 합니다.
4. 생물물리적 방법
1. MALS (다각도 광산란):용액 내 분자량 분포를 직접 제공합니다;
2. AUC (분석 초원심분리):침강 계수를 측정하여 단량체/이합체를 구분합니다;
3. 적용성:정확하지만 전문 장비와 정제된 샘플이 필요합니다.
권장 절차
1. 먼저 샘플 상태를 확인합니다 (원래 결합 상태를 유지해야 하는지, 약물이 안정적으로 존재하는지 여부).
2. SEC-MALS 또는 Native-PAGE 정량화를 우선적으로 사용하며, 조건이 제한적일 경우 비환원 SDS-PAGE + 밀도 측정을 결합하여 추정합니다.
3. 생물학적 반복을 설정하고 두 조건에서 동일한 총 단백질 및 동일한 버퍼 시스템을 유지할 것을 권장합니다.
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