단백질 분석 FAQ 모음
Loading Buffer에 추가되었지만 아직 끓여서 변성되지 않은 단백질 샘플은 장기 보관 시 단백질 안정성과 후속 실험의 호환성을 고려해야 합니다. 구체적인 권장 사항은 다음과 같습니다: 1. 추천 보관 조건 온도: -80°C로 변경하여 단백질 분해 및 단백질 효소 활성을 최대한 지연시키는 것이 좋습니다. 동결 형태: 원관 그대로 동결 보관할 수 있으며, 별도의 분리 없이 냉동 가능하지만 샘플 양이 많을 경우 사용량에 따라 나누어 보관하는 것이 좋습니다. 반복적인 동결 해동을 피해야 하며, SDS가 포함된 Loading Buffer의 동결 해동은 SDS 침전, 샘플 불균일 및 젤 상의 이동 이상을 초래할 수 있습니다. 2. 사용 전 처리 권장 실험 당일 사용 후 즉시 끓여야 합니다 (95–100°C, 5분); 동결 후 샘플에서 SDS 침전물이나 층이 발생하는 경우, 끓이기 전에 부드럽게 회전 혼합하거나 짧은 온수 욕조(37–50°C)에서 용해시킬 수 있습니다. 3. 기타 추가 권장 사항 샘플에 단백질 효소(예: Protease Inhibitor를 추가하지 않은 경우)가 포함되어 있거나 단백질이 불안정한 샘플 유형(예: 조직 용해액)인 경우, 냉동 전에 단백질 효소 억제제를 추가하는 것을 고려할 수 있습니다; 동결 전에 반복적인 동결 해동 작업을 피해야 하며, 특히 여러 Western blot 배치를 준비하는 경우에 적합합니다.
• 단백질 재가열 온도 시간은 얼마나 되나요? 희석한 후에도 끓일 수 있나요?
단백질 샘플의 재가열(즉, 가열 변성)은 일반적으로 SDS-PAGE 샘플링 전에 단백질의 고급 구조를 파괴하여 전기영동 이동이 주로 분자량을 반영하도록 합니다. 구체적인 재가열 온도와 시간은 다음과 같습니다: 1. 일반적인 재가열 조건 온도: 95°C 또는 100°C(끓는 물) 시간: 5분 샘플이 점성이 있거나 고농도이며 막 단백질 등의 복잡한 성분이 포함된 경우 적절히 10분으로 연장할 수 있지만 과도한 끓임으로 단백질이 분해되는 것을 피해야 합니다. 2. 희석 후 다시 끓일 수 있나요? 가능합니다. 하지만 다음 사항에 유의해야 합니다: 1. Buffer 시스템이 완전해야 합니다. 희석된 샘플에도 여전히 환원제(DTT 또는 β-머캡토에탄올)와 SDS가 포함되어야 충분한 변성과 환원이 이루어집니다. 그렇지 않으면 끓이는 의미가 없습니다. 2. 희석 배수는 너무 많지 않아야 합니다. 너무 많이 희석하면 단백질 농도가 너무 낮아져 밴드 선명도에 영향을 줄 수 있습니다. 일반적으로 희석 후에도 >0.5 μg/μL를 유지하는 것이 좋습니다. 3. 끓인 후 오랫동안 방치하지 않는 것이 좋습니다. 재가열이 완료된 샘플은 가능한 빨리 샘플링하는 것이 좋으며, 특히 SDS 및 환원제가 포함된 시스템은 분해되거나 침전물이 형성되기 쉬운 경향이 있습니다.
• SUMO 관련 실험은 일반적으로 어떻게 설계됩니까? Western Blot을 사용하는 경우 어떤 종류의 항체를 선택해야 합니까? 실험 시스템을 자체적으로 구축할 수 있습니까?
SUMO(작은 유비퀴틴 유사 수정) 수정에 대한 연구에서, 실험 설계는 특정 연구 목적(예: 전체 SUMO화에 대한 관심, 특정 위치 수정 또는 특정 기질 단백질)에 따라 정확하게 구분해야 합니다. 다음은 계층적으로 설명합니다: 1. 일반적인 SUMO 관련 실험 설계 전략 1) 총 SUMO화 수준 검출 목적: 세포/조직에서 SUMO화의 동적 변화를 관찰합니다. 예: 스트레스, 약물 처리 등 조건에서. 방법: Western blot을 사용하여 전체 SUMO화 단백질 스펙트럼을 검출합니다. 일반적으로 SUMO1, SUMO2/3 항체를 사용하여 Smear(끌기) 신호를 검출합니다. 2) 특정 위치/특정 기질 단백질의 SUMO화 검출 목적: 특정 단백질이 SUMO화되었는지 확인하거나 특정 수정 위치를 식별합니다. 방법: Co-IP + WB 또는 Ni-NTA 침강 + WB를 통해 SUMO화 형태를 검출하고, 돌연변이체(예: K→R)를 사용하여 수정 위치를 검증합니다. 3) SUMO E1/E2/E3 효소 시스템 간섭 실험 목적: SUMO화 조절 메커니즘을 연구합니다. 방법: SAE1/2, UBC9, PIAS 가족 등 SUMO 효소의 유전자 결실/과발현을 통해 기질 수정 변화를 관찰합니다. 4) 세포 위치 및 기능 실험 목적: SUMO화가 단백질 기능에 미치는 영향을 관찰합니다. 방법: GFP 융합 단백질 + 돌연변이체(WT.....
• 질량 분석 펩타이드 서열 식별을 완료한 후 결과를 어떻게 분석해야 합니까?
질량 분석을 통해 펩타이드 서열 식별 결과를 얻은 후, 다음 단계 분석은 연구 목표(정성, 정량, 기능 연구)에 따라 단계별로 진행해야 합니다. 일반적인 절차는 다음과 같습니다: 첫째, 결과 품질 관리 및 필터링 데이터베이스 검색 결과의 점수 지표(예: Peptide/Protein FDR, Score, Unique peptide 수)를 확인합니다. 신뢰도가 낮은 단백질이나 단 하나의 펩타이드만 지지하는 결과를 제외하여 데이터의 신뢰성을 보장합니다. 둘째, 단백질 정성 및 정량 정리 식별만 하는 경우 식별된 단백질 목록, UniProt ID, 커버리지 등을 정리합니다. 정량이 포함된 경우(Label-free, TMT 등) 각 샘플의 단백질 농도 행렬을 요약하고 정규화 및 결측값 처리를 수행해야 합니다. 셋째, 차별 분석(그룹 비교가 있는 경우) 통계 검정(t 검정, ANOVA 등)을 통해 차별 단백질을 선별합니다. 일반적으로 Fold Change 및 유의성 임계값(예: FC≥1.5 또는 2, p<0.05)을 설정해야 합니다. 넷째, 기능 주석 및 경로 풍부화 데이터베이스(GO, KEGG, Reactome)를 사용하여 기능 분류를 수행합니다. 풍부화 분석을 통해 차별 단백질의 생물학적 의미를 평가합니다. 다섯째, 추가 데이터 탐색 단백질 상호작용 네트워크(STRING, Cytoscape); 전사체 및 대사체 데이터와 통합하여 조절 메커니즘을 탐색합니다.
• 변성되지 않은 단백질은 더 쉽게 분해될까요? 추출한 단백질을 -80°C에서 얼마나 오래 보관할 수 있나요?
두 가지 측면을 구분해야 합니다: 단백질 자체의 구조 상태와 보관 조건이 안정성에 미치는 영향. 첫째, 변성되지 않은 단백질의 분해 위험 자연적인 형태의 단백질은 완전한 공간 구조를 유지하며, 일반적으로 활성도 유지됩니다. 용액에 잔여 단백질 분해효소나 미량의 금속 이온이 존재할 경우, 이러한 단백질은 쉽게 인식되고 절단되어 분해 속도가 빠릅니다. 변성 처리(예: SDS 추가, 요소, 가열)는 구조와 활성을 잃게 하며, 대부분의 단백질 분해효소는 절단하기 어렵지만, 변성 상태는 일반적으로 기능 검사나 구조 연구에 적합하지 않습니다. 따라서, 변성되지 않은 단백질은 단백질 분해효소 활성을 엄격히 억제(단백질 분해효소 억제제 혼합물 추가)하고 저온을 유지해야 합니다. 둘째, -80°C 보관 기간 글리세롤(일반적으로 10–50%)이나 적은 양의 완충염을 포함한 조건에서 단백질은 -80°C에서 수개월에서 1년까지 안정적으로 보관할 수 있으며, 이는 단백질 자체의 안정성(구조 복잡성, 이황화 결합, 막 단백질 여부 등)에 따라 다릅니다. 보호제가 없고 단지 PBS나 수용액으로 보관할 경우, 동결-융해 사이클은 구조에 심각한 영향을 미치며, 일반적으로 몇 주에서 1–2개월 후에 활성이 눈에 띄게 감소합니다. 잦은 동결-융해를 피하는 것이 좋습니다: 소량으로 나누어 사용하도록 권장합니다. 단백질 종류, 후속 용도(활성 검사, 구조 연구 또는 질량 분석)를 명확히 하고, 적절한 완충 체계와 보호제를 선택하며, 제조 시 광범위 단백질 분해효소 억제제를 추가하여 보관 기간을 현저히 연장하는 것이 좋습니다.
• 액체 크로마토그래피에서 면적과 시간을 통해 다양한 개입에서 상대 농도의 높낮이를 어떻게 볼 수 있나요?
액체 크로마토그래피(LC) 분석에서, 샘플 내 목표 물질의 상대 농도는 일반적으로 피크 면적(peak area)으로 평가되며, 시간(보유 시간, Retention Time, RT)은 주로 성분의 신원을 확인하는 데 사용되며 농도를 직접적으로 나타내지 않습니다. 다양한 개입 조건에서 목표 물질의 농도를 비교하려면 다음 단계를 따라야 합니다: 1. 해당 화합물의 보유 시간 고정. 다양한 조건에서 보유 시간은 미세한 변동이 있을 수 있으므로, 표준품이나 특성 이온(질량 분석과 연계 시)을 통해 같은 화합물을 확인해야 합니다. 같은 피크로 확인한 후에만 면적을 비교할 수 있습니다. 2. 피크 면적을 사용하여 상대 농도 반영. 피크 면적은 주입량이나 샘플 내 해당 성분의 농도와 비례합니다(방법의 선형 범위 내에서). 다양한 개입 그룹을 비교할 때는 동일 화합물 피크의 면적 크기만 비교하면 됩니다. 면적이 크면 → 상대 농도가 높습니다. 3. 정규화 또는 내표준 교정. 서로 다른 그룹 샘플의 주입 부피나 검출 조건에 약간의 차이가 있을 경우, 내표준 또는 총 피크 면적을 사용하여 정규화해야 시스템 오차를 피할 수 있습니다. 4. 기저선, 분리도 및 검출기 선형 범위 주의. 피크 적분의 일관성을 보장하고, 꼬리짐 또는 분리되지 않은 피크로 인한 면적 오판을 피해야 합니다. 피크 강도가 검출기 포화에 가까워지면 희석한 후 정량해야 합니다. 5. 요약. 다양한 개입 그룹의 상대 농도는 주로 동일 화합물의 피크 면적 크기로 판단하며, 보유 시간은 화합물의 신원을 확인하는 데만 사용되고 농도 비교에는 사용되지 않습니다.
• 눈물 샘플을 수집하는 모세관은 일회용 미세 채혈 흡입관인가요?
일반적으로 눈물 샘플을 수집하는 모세관은 일반적인 일회용 미세 채혈 흡입관이 아니라, 특별히 첨가물이나 코팅이 없는 유리 또는 플라스틱 모세관입니다. 일반적인 규격은 내경 0.5–1.0 mm, 길이 약 5–10 cm, 용량은 대개 1–10 µL입니다. 주요 차이점 1. 항응고제나 기타 첨가물이 없음: 채혈용 모세관은 보통 내벽에 헤파린이나 기타 항응고제가 코팅되어 있어, 이후 단백질 체계나 대사 체계 분석에 방해가 될 수 있습니다. 2. 흡착 코팅이나 불활성 처리 없음: 눈물 샘플의 양이 매우 적고, 단백질 및 대사물의 농도가 낮기 때문에, 어떤 코팅도 분석물 손실이나 배경 유입을 초래할 수 있습니다. 3. 정밀 용량 조절: 눈물 수집은 종종 정량이 필요하며(예: 눈물 유량 테스트 또는 정량 체계에 사용), 알려진 내경과 정밀 눈금을 가진 모세관을 사용해야 합니다. 권장 사항 1. 눈물 또는 미세 생물액체 수집을 위해 설계된 무코팅 모세관 유리관(borosilicate capillary tube)을 사용하고, 채혈관은 피하십시오. 2. 수집 후 양쪽 끝을 즉시 밀봉하여 증발을 방지하고, 저온에서 보관하여 샘플 손실을 줄이십시오.
• 약물 추가 여부에 따른 이량체 함량을 어떻게 판단하나요?
약물 추가와 비추가 조건에서 이량체 함량을 정확히 비교하려면 다음을 명확히 해야 합니다: 단백질 특성(용해성 여부, 집합 용이성 여부), 검사 환경(체외에서 정제된 단백질 또는 세포/조직 용해액), 목표가 정성 분석인지 정량 분석인지. 일반적으로 다음 전략을 고려할 수 있습니다: 1. 겔 전기영동 결합 정량 1. 원리: 이량체는 비환원성, 저변성 조건에서 단량체와의 구조적 차이를 유지할 수 있습니다. 2. 방법: 비환원 SDS-PAGE 또는 Native-PAGE로 분리; 염색 후 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 단량체 및 이량체 밴드의 회색도를 적분하여 이량체 비율을 계산합니다; 샘플 양은 선형 범위 내에 있어야 하며, 집합 또는 과량 샘플로 인한 가양성을 피해야 합니다. 3. 적합성: 간단하고 직관적이지만, 약한 결합 또는 동적 평형 이량체는 과소평가될 수 있습니다. 2. SEC(사이즈 배제 크로마토그래피)/ HPLC 1. 원리: 분자량에 따라 분리하여 단량체 및 이량체 피크를 구분할 수 있습니다. 2. 방법: 표준 곡선(외부 표준 단백질 또는 알려진 농도의 정제된 목표 단백질)을 통해 피크 면적을 정량화합니다; 정확성을 높이기 위해 MALS(다각도 광산란) 또는 UV 검출과 함께 사용하는 것이 좋습니다. 3. 적합성: 더 정확한 비율을 제공할 수 있으며, 약물이 유도한 이량체 전이를 감지할 수 있습니다. 3. 크로스링크 결합 질량 분석(Crosslinking-MS) 또는 화학적 크로스링크 + 웨스턴 1. 원리: 약물이 이량체의 동적 변화를 변화시킬 수 있으며, 교차결합 후 특정 이량체를 검출할 수 있습니다. 2. 방법: 온화한 교차결합제를 사용합니다(예: .....
• IP 샘플이 실온에서 거의 하루 동안 방치되었고(이미 끓였음), 꺼내는 것을 잊고 기계가 밤에 꺼졌는데, 계속 사용할 수 있습니까?
다음 몇 가지 사항을 특히 고려해야 합니다: 1. 단백질의 완전성 1. 이미 끓였으므로(일반적으로 SDS와 환원제가 포함되어 있음) 샘플의 대부분의 자연 구조와 효소 활성은 파괴되었으며, 이론적으로 더 이상의 유의미한 분해는 발생하지 않습니다. 2. 그러나 장시간 실온에 노출되면 일부 쉽게 침전되거나 불용성 성분이 집합될 수 있으며, 특히 고농도의 SDS 또는 요소가 포함된 경우 온도가 저하된 후 쉽게 침출됩니다. 2. 미생물 오염 및 완충 시스템 1. 완충액에 항균제가 없다면(고농도의 SDS 이외) 장시간 실온에 방치하면 여전히 세균이 발생하여 샘플이 탁해지거나 분해될 수 있습니다. 2. Tris와 같은 완충 시스템은 실온에서 pH가 약간 변화할 수 있지만 일반적으로 큰 영향은 없습니다. 3. 후속 용도에 따라 계속 사용할 수 있는지 결정됩니다. 1. SDS-PAGE/Western blot에만 사용할 경우: 기본적으로 계속 사용할 수 있지만, 가능하면 침전물을 제거하기 위해 원심분리 하는 것이 좋으며, 필요시 다시 끓일 것을 권장합니다. 2. 효소 실험이나 질량 분석(특히 정량적 질량 분석)을 수행해야 하는 경우: 직접 사용하지 않는 것이 좋습니다. 오염 및 수정(산화, 탈아미노화) 위험이 높아 데이터 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다. 권장 처리: 먼저 원심분리를 통해 명백한 침전물이나 혼탁함이 있는지 확인합니다. WB만 수행하는 경우 직접 사용하거나 다시 끓인 후 사용할 수 있습니다. 질량 분석이나 기능 실험을 수행하는 경우, 다시 조제하는 것이 좋으며, 최소한 영향을 평가하기 위해 대조군을 하나 준비하는 것이 좋습니다.
• docking 소프트웨어를 사용하여 펩타이드 예측 후 어떤 방법으로 결합을 검증해야 할까요?
일반적으로 분자 도킹(docking)으로 펩타이드와 표적 단백질의 결합 양상을 예측한 후, 실험적 방법을 통해 결합 친화력과 특이성을 검증해야 합니다. 일반적으로 사용되는 방법은 두 가지로 나눌 수 있습니다: 1. 생화학적 또는 생물물리적 방법(직접 결합 측정) 1) 표면 플라스몬 공명(SPR)은 실시간 결합 동역학 매개변수(ka, kd) 및 평형 해리 상수(KD)를 얻을 수 있으며, 친화력 및 동역학적 특성을 검증하는 데 적합합니다. 2) 등온 적정 열량법(ITC)은 결합 열역학 매개변수(ΔG, ΔH, ΔS) 및 친화력을 직접 측정할 수 있으며, 높은 친화력 시스템에 적합합니다. 3) 미세 열 운동(MST)은 샘플 요구 사항이 낮아 결합 상수를 신속하게 평가할 수 있습니다. 4) 형광 편극(FP) 또는 FRET은 소분자/펩타이드와 단백질의 결합 스크리닝에 사용될 수 있지만, 표지가 필요합니다. 2. 세포 또는 기능적 수준의 검증(간접 증명) 1) 공동 면역 침전(Co-IP) 또는 풀다운 실험은 펩타이드와 단백질이 세포 내 또는 체외에서 복합체를 형성하는지 검증합니다. 2) 기능성 실험(신호 경로 활성화/억제, 효소 활성 억제 등)은 결합이 생물학적 효과를 가지는지 검증합니다. 제안: 초기 스크리닝 단계에서는 MST 또는 SPR을 사용하여 펩타이드와 표적의 실제 친화력을 평가하고, 도킹 예측 결과와 비교하는 것이 좋습니다. 높은 우선순위 후보는 ITC를 사용하여 열역학 매개변수를 정확하게 측정합니다. 결합이 안정적이고 생물학적 기능이 있다면, 세포 기능 실험을 통해 생리적 관련성을 검증합니다.
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