소분자 약물 표적 확인 및 검증

현대 의약품 발견 및 개발 과정에서, 약물 타겟과 작용 방식은 여전히 두 가지 주요 과제입니다. 올바른 약물 작용 타겟은 약물의 효능과 특이성과 관련이 있을 뿐 아니라, 약물의 안전성과 잠재적인 부작용 문제도 연관되어 있습니다. 약물 타겟은 약물이 생체 내 생체대분자와 직접 결합하는 부위를 말하며, 주요 타겟으로는 수용체, 효소, 이온 채널, 운반체, 핵산 등이 있습니다. 약물 작용 타겟을 식별하는 것은 신약 설계에 매우 중요하며, 이는 약물의 작용 기전을 이해하고, 약물 활성과 생물학적 기능 간의 연결을 형성하며, 잠재적인 부작용과 내약성 메커니즘을 예측하고, 새로운 치료 타겟을 발견하는 데 도움을 줍니다. 타겟 식별을 통해 약물 개발 과정의 효율성과 약물 출시 후 안전성을 보장할 수 있습니다.

새로운 약물 작용 타겟은 일련의 신약 발견에 있어 돌파구입니다. 약물 작용의 새로운 타겟을 찾는 것은 오늘날 혁신 약물 개발의 치열한 경쟁의 초점이 되었습니다. 약물 개발 관점에서, 약물의 효과는 크게 그 작용 타겟에 달려 있습니다. 현재 주요 약물 발견 전략으로는 페노타입 기반 약물 발견과 타겟 기반 약물 발견이 있습니다. 페노타입 기반 약물 발견은 기존의 약리학에 따라, 세포, 조직 또는 기관에서 소분자나 펩타이드를 스크리닝합니다. 타겟 기반 약물 발견은 먼저 타겟을 결정한 후 활성 분자를 식별하는 과정을 포함합니다. 분자 생물학의 빠른 발전과 함께, 타겟 기반 약물 발견 패러다임이 기존의 페노타입 기반 방법을 대체하였으며, 이는 스크리닝 능력을 향상시키고 합리적인 약물 발견 계획을 정의할 수 있게 합니다.

효소를 약물 타겟으로

바이오테크놀로지 기업 BTP는 고해상도 질량 분석 플랫폼을 기반으로, 친화 크로마토그래피 기술과 활성 부위 지향 프로브 기술을 결합하여, 여러 타겟 기반 소분자 약물 타겟 식별 플랫폼을 개발 및 검증하였습니다. 이를 통해 단백질-단백질 상호작용(PPI) 및 단백질-소분자 약물 상호작용을 포함한 분자 간 상호작용 식별 전체 과정을 위한 연구 서비스를 제공합니다. BTP의 타겟 기반 소분자 약물 타겟 식별 솔루션은 다음을 포함합니다:

1. ABPP 기반의전략을 활용한 소분자 약물 타겟 식별 및 검증

활성 기반 단백질 분석(Activity-based protein profiling, ABPP)은 활성 기반 프로브와 단백질체학 기술을 결합하여,소분자의 단백질 타겟, 심지어 타겟 단백질의 활성 부위를 식별하는 데 사용됩니다.ABPP는 두 가지 요소로 구성된 활성 부위 지향 화학 프로브를 활용합니다: 1) 활성 부위 지향 반응 그룹, 이는 촉매 관련 효소의 특정 하위 집합(또는 패밀리)과 결합하고 공유 결합으로 표시하며, 2) 보고 태그(예: 형광단, 생비오틴, 알킨 또는 아지드)는 탐지/정량 및/또는 농축/식별된 효소를 식별하기 위한 것입니다. 원칙적으로, 소분자의 활성 그룹은 타겟 단백질 및 보고 그룹과 직접 상호작용하여 타겟 포획을 촉진합니다. 선택된 보고 그룹에 따라 다양한 후속 실험이 가능합니다. 예를 들어, 형광 그룹은 세포 또는 동물 내 소분자의 위치를 빠르게 젤 스크리닝하고 식별하는 데 사용될 수 있으며, 생비오틴은 단백질 농축에 사용된 후 질량 분석을 통해 타겟 단백질을 식별할 수 있습니다.

Front Pharmacol. 2018 Apr 9;9:353.

활성 기반 단백질 분석 작업 흐름

서비스 내용

기술적 장점

1) 특이성: 특정 활성 프로브를 통해 활발한 효소를 표적으로 하여, 높은 특이성으로 활성 단백질을 식별할 수 있습니다.

2) 기능적 분석: 단백질의 효소 활성 상태를 직접 평가할 수 있으며, 단순히 발현량이나 구조 변화에 그치지 않습니다.

3) 실시간 모니터링: 세포 내 생리 조건에서 효소의 활성을 모니터링할 수 있으며, 약물의 즉각적인 영향을 포착할 수 있습니다.

4) 비침습적 표시: 프로브와 단백질의 공유 결합은 비침습적이며, 표본의 생리적 진실성을 유지하면서 정상 기능을 방해하지 않습니다.

5) 샘플 적합성: ABPP 기술은 세포 용해물, 활생세포, 동물 용해물, 심지어 살아있는 동물에도 적용될 수 있습니다.

2.TPP 기반 소분자 약물 타겟식별

열 단백질체 분석(thermal proteome profiling, TPP)은 소분자 화합물과 단백질 간의 상호작용을 포괄적으로 이해하는 것을 목표로 합니다. 그 핵심 원리는 단백질이 열에 노출될 때 변성되며 용해되지 않는다는 사실에 기반합니다. 단백질은 소분자(예: 약물 또는 대사물), 핵산 또는 기타 단백질과의 상호작용 또는 번역 후 수정 시 열 안정성을 변경할 수 있습니다. TPP는 다중 정량 질량 분석 기반 단백질체학을 사용하여 수천 가지 발현 단백질의 용융 곡선을 모니터링합니다. 중요한 것은,이 방법은 체외, 원위치 또는 체내에서 진행될 수 있습니다.TPP는 약물의 타겟과 비타겟 식별, 단백질-대사물 및 단백질-단백질 상호작용 연구, 대사물 결합 단백질 식별 및 다양한 뉴클레오타이드와 상호작용하는 단백질 맵핑에 성공적으로 적용되었습니다.

Nat Prod Rep. 2016; 33(5):719-730.

TPP 기반 소분자 약물 타겟 식별 작업 흐름

서비스 내용

기술적 장점

1) 전역적 및 비편향적: 전체 단백질체 수준에서 소분자와 단백질의 상호작용을 편향 없이 탐색할 수 있습니다.

2) 세포 내 작용 분석: 세포의 생리적 환경에서 실제 약물-단백질 상호작용을 포착하여 약물의 실제 작용을 반영합니다.

3) 정량성: 약물-타겟 상호작용의 강도와 안정성에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

4) 데이터 신뢰성: TPP는 여러 온도 포인트에서 동시에 수행될 수 있어 실험 설정으로 인한 편차를 줄이고 데이터의 재현성과 신뢰성을 높입니다.

LiP-MS 기반 소분자 약물 타겟 식별

제한적 프로테아제 소화-질량분석(Limited Proteolysis-Mass Spectrometry, LiP-MS)은 제한적 프로테아제 소화와 질량 분석을 결합한 기술로, 특정 조건 하에서 프로테아제가 단백질을 제한적으로 절단하여 생성된 단백질 조각을 질량 분석을 통해 식별합니다. 소분자 약물 타겟 식별 과정에서, 소분자 약물과 그 잠재적 단백질 타겟을 배양하고, 약물 분자가 단백질과 결합하면 단백질의 구조적 변화를 유발합니다. 이러한 변화는 단백질의 소화 패턴에 영향을 미치며, 약물 처리와 미처리 조건에서 단백질 소화 조각을 비교함으로써 약물과 상호작용하는 단백질 영역을 식별할 수 있으며, 이를 통해 약물의 작용 타겟을 추론할 수 있습니다. 이는 약물 메커니즘의 해석과 신약 발견에 매우 중요하며, 특히 약물 분자 설계와 약물 효능 최적화에 있어 중요합니다.

Piazza, et al. 2018, Cell 172, 358-372.

LiP-MS 기반 소분자 약물 타겟 식별 작업 흐름

서비스 내용

기술적 장점

1) 고처리량 및 고감도: LiP-MS는 수천 개의 단백질 샘플을 분석할 수 있으며, 낮은 농도의 단백질 타겟도 식별할 수 있습니다.

2) 사전 지식 불필요: 이 방법은 잠재적 타겟에 대한 사전 정보가 필요하지 않으며, 광범위한 단백질에서 알려지지 않은 약물 작용점을 발견할 수 있습니다.

3) 체외 및 체내 적용성: LiP-MS는 체외에서 수행될 수 있으며, 체내에서도 적용 가능하여 약물이 타겟과 상호작용하는 방법에 대한 더 많은 정보를 제공합니다.

4) 구조적 동적 분석: LiP-MS는 소분자가 단백질과 결합한 후 단백질 구조 변화의 동적 과정을 제공합니다.

DARTS 기반 소분자 약물 타겟 식별

약물 친화성 반응 타겟 안정성(Drug affinity responsive target stability, DARTS)은 소분자의 잠재적 단백질 타겟을 상대적으로 신속하고 직접적으로 식별하는 방법으로, 이는 소분자와의 상호작용을 통해 타겟 단백질이 단백질 분해로부터 보호되는 것을 기반으로 합니다. DARTS는 관심 있는 화합물과 운반체 대조 또는 비활성 유사물을 사용하여 세포 용해물의 동일 분량을 처리한 후, 세포 용해물의 단백질을 단백질 분해 효소로 제한적으로 소화하여 수행됩니다. 그런 다음 SDS-PAGE를 통해 샘플을 분리하고 염색하여 소분자 단백질 분해로부터 보호된 단백질 밴드를 식별합니다. 마지막으로 질량 분석(MS)을 사용하여 각 밴드에 존재하는 단백질을 식별합니다. 이 비편향적 방법은 천연물 및 기타 생물 활성 소분자의 새로운 단백질 타겟 식별에 성공적으로 사용되었습니다.

Nat Prod Rep. 2016; 33(5):719-730.

DARTS 기반 소분자 약물 타겟 식별 작업 흐름

서비스 내용

기술적 장점

1) 비표지성: DARTS의 최대 장점은 천연 소분자를 사용할 수 있다는 점으로, 약물이나 단백질을 고정하거나 수정할 필요가 없습니다(예: 생비오틴, 형광, 방사성 동위원소 삽입). 이를 통해 약물 활성이나 단백질 구조에 영향을 미칠 수 있는 문제를 피할 수 있습니다.

2) 직접성: 복잡한 생물 샘플에서 직접 수행할 수 있으며, 단백질 정제가 필요하지 않아 데이터가 생리적 상태에 더 가깝습니다.

3) 충실성: 약물과 잠재적 타겟의 생리적 상호작용을 보존하여 더 진정한 약물-타겟 상호작용 정보를 제공합니다.

4) 광범위한 적용성: 화학적 성질과 무관하게 모든 유형의 소분자 약물에 사용할 수 있으며, 동물, 진균, 세균 및 식물로부터 유래한 단백질 추적에 널리 사용되었습니다.

5) 시효성 및 경제성: 실험 단계가 상대적으로 간단하고 빠르며, 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있으며, 비싼 장비와 시약이 필요하지 않아 경제적입니다.