지난 수십 년간, 질량 분석(MS)을 기반으로 한 프로테오믹스는 단백질-단백질 상호작용 분석(PPIs)의 중요한 기술로 자리 잡았습니다. 단백질은 다른 단백질이나 화합물과 상호작용하여 대분자 화합물을 형성하고 생물학적 기능을 발휘합니다. 단백질 상호작용 연구는 단백질을 더 잘 이해하는 데 도움을 줍니다. IP, CO IP 또는 GST pull-down 등의 단백질 상호작용 분석 방법을 통해 타겟 단백질을 얻은 후, 질량 분석을 통해 이를 분석, 식별 및 정량화하여 상호작용 단백질을 특성화하고 단백질 기능을 분석할 수 있습니다. 친화성 정제와 질량 분석을 결합한 방법(Affinity purification combined with mass spectrometry, AP-MS)은 특정 생리 조건에서 편향 없이 상호작용 단백질을 검출할 수 있도록 합니다. 한 방법으로 SILAC 방법을 사용하여 실험군과 대조군 세포를 각각 라벨링한 후 Co-IP 실험을 수행하며, 항원과 항체 간의 특이적 반응을 통해 면역 복합체를 분리합니다. 그런 다음 LC-MS/MS로 면역 복합체의 단백질을 정성/정량 분석합니다. 실험군과 대조군에서 특정 단백질의 함량이 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우, 해당 단백질이 연구 중인 단백질과 상호작용한다고 판단할 수 있으며, 단백질 상호작용의 가양성 가능성을 크게 줄일 수 있습니다. SILAC 기술과 Co-IP-MS 기술을 결합하면 특정 상황에서 단백질의 상호작용 단백질 네트워크를 고처량으로 정량 분석할 수 있습니다.
질량 분석으로 상호작용 단백질을 식별하는 두 가지 흔한 방법은 펩타이드 지문 분석법(peptide fingerprinting)과 샷건 프로테오믹스 분석법(shot-gun proteomics)입니다. 펩타이드 지문 분석법은 SDS-PAGE를 사용하여 단백질 샘플을 분리합니다. 폴리아크릴아미드 젤은 코마시 블루(coomassie)와 은염색 밴드를 사용할 수 있습니다. 그러나 샘플 밴드는 단일 밴드, 즉 하나의 단백질 밴드만 포함해야 합니다. 잘라낸 단백질 밴드를 효소로 소화한 후, 질량 분석으로 분석합니다. 소화된 펩타이드를 질량 분석한 후, 이론 데이터베이스와 비교하여 생물정보학 분석을 통해 목적 단백질의 정보를 조립합니다. 펩타이드 지문 분석법의 일부 제한점은, 이 방법이 젤 절단 과정에서 단일 단백질 밴드를 얻어야 하며, 잡음 밴드가 있으면 검출 정확도가 영향을 받을 수 있다는 점입니다. 잡음 밴드의 단백질 정보가 실제 목적 단백질의 정보를 가릴 수 있기 때문입니다. 따라서 비교적 순수한 단백질 샘플의 식별에 적합합니다. 반면 샷건 프로테오믹스 분석법의 강력한 점은 샷건 프로테오믹스가 단백질 혼합물을 분석할 수 있다는 것입니다.
샷건 프로테오믹스의 원리는 단백질 샘플을 먼저 펩타이드로 소화한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법으로 분리하는 것입니다. 분리된 펩타이드는 직접 질량 분석기로 들어가 분석됩니다. 질량 분석은 두 가지 과정으로 구성됩니다, 1차 질량 분석(MS1) 및 2차 질량 분석(MS2). 1차 질량 분석은 고성능 액체 크로마토그래피 MS1에서 용출된 펩타이드의 질량 대 전하 비율(m/z)과 펩타이드의 강도(intensity)를 얻습니다; 2차 질량 분석은 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하며, MS2는 단일 펩타이드를 선택하여 분해하여 해당 펩타이드의 스펙트럼 데이터를 얻습니다. 검색 소프트웨어는 2차 질량 분석 정보와 해당 데이터베이스를 비교하여, 일치 점수와 불일치 필터링을 결합하여 펩타이드의 정확한 서열을 얻고, 이를 통해 각 단백질의 전체 서열을 조립하여 단백질을 식별합니다.
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