세포 내 단백질의 동적 변화는 다양한 생명 과정에 중요한 영향을 미칩니다. 예를 들어, 많은 질병의 발생과 발전은 특정 단백질의 비정상적인 발현과 관련이 있습니다. 정량 단백질체학은 유전체에서 발현된 모든 단백질이나 복잡한 혼합 시스템의 모든 단백질을 정확하게 정량화하고 식별하는 기술입니다. 현재 정량 단백질체학 기술은 라벨링 전략과 비라벨링 전략으로 나눌 수 있으며, 라벨링 전략은 생체 내 라벨링(SILAC)과 생체 외 라벨링(iTRAQ, TMT)으로 나뉩니다.
iTRAQ는 2004년에 AB SCIEX에서 개발한 정량 단백질체학 연구 기술입니다. 이 기술은 여러 다른 샘플 내 단백질을 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 다양한 병리 조건 또는 발달 단계의 조직 샘플에서 단백질 발현 수준의 차이를 연구할 수 있습니다. 또한, iTRAQ는 유전체에서 발현된 모든 단백질이나 복잡한 혼합 시스템의 모든 단백질을 정확하게 정량화하고 식별할 수 있습니다. iTRAQ는 8개의 다른 동위원소 시약을 사용해 동시에 8개의 다른 단백질 샘플을 라벨링하고 비교할 수 있습니다. 라벨링 시약은 보고 그룹, 균형 그룹 및 아민 특이적 반응 그룹으로 구성됩니다.
iTRAQ의 작업 흐름
iTRAQ 기술의 일반적인 과정은 다음 그림과 같습니다. 간단히 말해, 샘플은 트립신 소화 후 알킬화되고 효소에 의해 펩타이드 조각으로 소화됩니다. 생성된 펩타이드 조각은 iTRAQ 시약의 라벨로 차별적으로 라벨링되며, 그런 다음 라벨링된 샘플을 혼합하여 LC-MS/MS 분석을 수행합니다.
네 가지 다른 샘플(S1-S4)의 다중 반응 일반 계획은 네 가지 다른 색상으로 표시됩니다(Zieske et al., 2006)
iTRAQ의 장점
1. 한 번의 실험으로 iTRAQ는 4에서 8개의 샘플을 동시에 라벨링할 수 있습니다. 조작이 간단하고 빠르며, 다수의 샘플에 대한 고효율 검출에 적합하며 실험 설계가 더욱 유연합니다.
2. iTRAQ는 펩타이드 수준에서 수행되는 생체 외 라벨링으로, 다양한 유형의 생물 샘플에 적합합니다.
3. iTRAQ는 반복성이 좋고 민감도가 높으며, 동시에 정성 및 정량 분석을 수행할 수 있습니다.
TMT는 미국 Thermo Fisher Scientific에서 개발한 펩타이드 생체 외 라벨링 기술입니다. 이 기술은 최대 10개의 동위원소 태그를 사용하여 펩타이드 아미노를 라벨링할 수 있습니다. LC-MS/MS 분석 후, 10개의 다른 샘플에서 단백질의 상대적 함량을 동시에 비교할 수 있습니다. TMT는 질병 바이오마커 스크리닝, 약물 작용 타겟, 동식물의 병저항성 또는 스트레스 저항성 메커니즘, 동식물의 발달 및 분화 메커니즘 등 다양한 분야에 널리 사용됩니다.
TMT의 작업 흐름
TMT의 일반적인 과정은 다음 그림과 같습니다. 다른 단백질 샘플을 변성, 환원, 알킬화하고 펩타이드 샘플로 소화합니다. 그런 다음 TMT 시약 키트로 라벨링된 펩타이드 샘플을 합쳐 하나의 샘플로 만듭니다. HPRP 액체 크로마토그래피를 사용하여 결합된 샘플을 분리하고, 결과물을 12개의 샘플로 연결합니다. 정제 후, HPLC-MS로 각 샘플을 분석합니다. 분석 데이터를 통해 단백질의 정성 및 상대 정량 정보를 얻습니다.
10plex TMT를 사용한 상대 정량화 과정(Zhang et al., 2017)
TMT의 장점
1. 높은 민감도: 저농도의 단백질을 감지할 수 있습니다.
2. 높은 분리 능력: 산/알칼리 단백질, 10KD 미만 또는 200KD 이상의 단백질, 불용성 단백질 등을 분리할 수 있습니다.
3. 넓은 응용 범위: 막 단백질, 핵 단백질 및 세포 외 단백질을 포함하여 모든 유형의 단백질을 식별할 수 있습니다.
4. 고효율: 10개의 샘플을 동시에 분석할 수 있으며, 다양한 처리 방법 또는 다양한 처리 시간의 샘플에 대한 차별 단백질 분석에 특히 적합합니다.
SILAC는 고효율 정량 단백질체학을 위한 효과적인 방법으로, 필수 아미노산에 의존하는 포유류 세포 증식을 기반으로 설계되었습니다. SILAC는 정량 단백질체학 연구에 사용되어 세포 내의 단백질 상호작용 및 단백질 발현 차이를 분석할 수 있으며, 복잡한 포유류 세포 단백질체학의 포괄적 시스템 정성 및 정량 분석을 위한 효과적인 솔루션을 제공합니다.
SILAC의 작업 흐름
SILAC의 일반적인 과정은 다음 그림과 같습니다. 세포 배양 매체에 가벼운, 중간 또는 무거운 안정 동위원소로 라벨링된 필수 아미노산(주로 라이신과 아르기닌)을 추가합니다. 세포의 정상적인 대사 과정을 통해 새로 합성된 모든 단백질은 안정 동위원소로 라벨링됩니다. 모든 유형의 단백질을 동일한 양으로 혼합하고, SDS-PAGE로 분리, 젤 절단 및 효소 소화 후, LC-MS/MS 분석을 통해 관련 단백질의 정량 및 정성 결과를 얻을 수 있습니다.
SILAC를 사용한 단백질 정량화(Esthelle et al., 2019)
SILAC의 장점
1. SILAC는 생체 수준의 라벨링 기술로, 라벨링 효과가 안정적이고 효율적이며, 라벨링 효율은 용해액의 영향을 받지 않습니다.
2. SILAC는 적은 샘플을 필요로 하며, 일반적으로 샘플당 수십 마이크로그램의 단백질만으로 충분합니다.
3. SILAC는 질량 분석법을 사용하여 다수의 단백질을 동시에 식별하고 정량화할 수 있습니다.
4. SILAC는 생체 내 라벨링 기술을 사용하여 샘플의 실제 상태에 가깝습니다.
참고 문헌
1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
