약물이 세포에 작용한 후 전사체 분석을 수행할 때, 약물 작용 시간은 어느 정도가 적합할까요? 샘플에 대한 요구 사항은 무엇인가요?
약물 작용 후 전사체 시퀀싱을 수행할 때 약물 작용 시간과 샘플 처리가 매우 중요합니다. 이는 실험 설계와 연구 목표에 따라 결정되어야 합니다. 다음은 몇 가지 제안 사항입니다:
1. 약물 작용 시간 선택
1. 시간 지점 선택
약물 작용 시간은 주로 약물의 메커니즘과 목표에 따라 결정됩니다. 일반적인 시간 지점은 다음과 같습니다:
- 단기 (1-6시간): 빠른 반응을 보이는 약물에 적합하며, 초기 유전자 발현 변화를 평가합니다.
- 중기 (12-24시간): 약물이 유도하는 세포 적응 또는 전사 조절을 관찰하기에 적합합니다.
- 장기 (24시간 이상): 세포 분화나 성장 억제와 같은 지속적인 효과를 연구하는 데 적합합니다.
2. 실험 설계
여러 시간 지점을 포함한 실험을 설계하여 약물이 전사체에 미치는 영향을 종합적으로 평가할 수 있습니다.
2. 샘플 요구 사항
1. 세포 상태 일관성
약물 작용 전에 모든 샘플의 세포가 동일한 성장 상태(예: 세포 밀도, 배양 시간)에 있도록 하여 세포 상태 차이에 의한 전사체 결과의 영향을 피해야 합니다.
2. 약물 처리 후 샘플 수집
(1) 신속한 처리: 약물 작용이 끝난 후 세포를 신속히 처리하여 전사체 변화를 방지해야 합니다. 일반적으로 차가운 PBS로 세포를 빠르게 세척하여 비특이적 유전자 발현을 방지합니다.
(2) RNA 안정성: 세포를 수집할 때 즉시 RNA 안정제를 첨가하여 RNA 분해를 방지해야 합니다. 샘플이 많을 경우, 각 배치의 처리 시간이 일관되도록 해야 합니다.
3. RNA 품질 관리
(1) RNA 추출: 적절한 시약(예: TRIzol 또는 칼럼법)을 사용하여 RNA를 추출하고, RNA의 순도와 완전성을 보장해야 합니다. RNA 샘플의 OD260/280 비율은 1.8-2.0 사이여야 하며, 이는 샘플 순도가 적합함을 나타냅니다.
(2) RNA 완전성: Agilent 2100 Bioanalyzer 또는 유사 장비를 사용하여 RNA 품질을 평가하고, RNA 완전성 수치(RIN 값)는 ≥7이어야 하며, 이는 샘플이 전사체 시퀀싱에 적합함을 보장합니다.
4. 생물학적 반복
데이터의 신뢰성을 보장하기 위해 각 실험 조건에 대해 최소 세 번의 생물학적 반복(n=3)이 필요하며, 이는 통계적으로 유의한 차이 유전자 발현을 분석하는 데 도움이 됩니다.
5. 대조군 설정
약물 처리 그룹 외에도 대조군을 설정해야 합니다. 대조군은 일반적으로 약물을 처리하지 않은 세포이거나 약물 용매(예: DMSO)로 처리하여 비약물 요인에 의한 유전자 발현 변화를 배제합니다.
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