전사체 시퀀싱 결과를 어떻게 분석해야 할까요?
RNA-Seq 결과가 반환된 후 분석 단계는 일반적으로 다음과 같은 주요 단계를 포함하며, 각 단계에는 특정 처리 방법과 소프트웨어 도구가 있습니다.
1. 데이터 품질 관리
1. FastQC 분석: FastQC 등의 도구를 사용하여 원시 데이터의 품질을 평가하고, 염기 품질 점수, GC 함량, 시퀀스 길이 분포 등을 평가합니다.
2. 데이터 트리밍: Trimmomatic 또는 Cutadapt 등의 도구를 사용하여 낮은 품질의 시퀀스, 어댑터 시퀀스 및 너무 짧은 리드를 제거하여 후속 분석의 정확성을 보장합니다.
2. 시퀀스 정렬
1. 정렬 소프트웨어 선택: HISAT2, STAR 등의 도구를 사용하여 처리된 리드를 참조 유전체 또는 전사체에 정렬합니다. 정렬 선택은 시퀀싱 플랫폼, 종 및 유전체의 복잡성에 따라 다릅니다.
2. 정렬률 평가: 정렬률을 확인하여 시퀀싱 데이터의 품질과 참조 유전체의 적합성을 판단합니다. 일반적으로 고품질 RNA-Seq 실험은 높은 정렬률(>70%)을 가져야 합니다.
3. 전사체 조립 및 정량화
1. StringTie 또는 Cufflinks: 전사체 조립이 필요한 경우, StringTie 또는 Cufflinks 등의 도구를 사용하여 정렬 결과를 기반으로 새로운 전사체 또는 새로운 유전자를 식별합니다.
2. 유전자 발현 정량화: HTSeq, FeatureCounts, Salmon 또는 Kallisto 등의 도구를 사용하여 유전자 및 전사체의 발현량을 정량화하며, 일반적으로 FPKM, TPM, 또는 raw counts 등의 형태로 표현됩니다.
4. 차등 발현 분석
1. 차등 발현 분석 도구: DESeq2, EdgeR 및 limma 등의 도구를 사용하며, 실험 설계와 데이터 특성에 따라 적합한 소프트웨어를 선택합니다.
2. 표준화 및 정규화: 차등 발현 분석 전에는 데이터의 표준화를 통해 시퀀싱 깊이와 유전자 길이의 영향을 줄여야 하며, DESeq2 등의 도구는 이러한 표준화 단계를 자체적으로 포함하고 있습니다.
3. 차등 유전자 선별: 설정된 임계값(예: p값 < 0.05, |log2 Fold Change| > 1)에 따라 유의한 차등 발현 유전자(DEGs)를 선별하며, 이러한 유전자는 후속 기능 분석의 초점이 됩니다.
5. 기능 주석 및 경로 분석
1. GO 분석: GO 데이터베이스를 사용하여 차등 유전자를 기능적으로 주석하여, 생물학적 과정(BP), 분자 기능(MF) 및 세포 구성(CC) 측면에서의 풍부성을 이해합니다.
2. KEGG 경로 분석: KEGG 데이터베이스 또는 ClusterProfiler, DAVID 등의 경로 분석 도구를 사용하여 차등 유전자를 경로 풍부성 분석하여, 이러한 유전자가 대사 및 신호 경로에서 수행하는 역할을 이해합니다.
6. 시각화 분석
1. 화산도 및 히트맵: ggplot2, pheatmap 등의 R 패키지를 사용하여 화산도 및 히트맵을 그려 차등 발현 유전자의 유의성과 발현 패턴을 시각화합니다.
2. 주성분 분석(PCA) 및 계층적 군집 분석: PCA 및 군집 분석을 통해 샘플 간 차이와 유사성을 평가하고, 이상 샘플 또는 배치 효과가 있는지 확인합니다.
7. 기타 분석(옵션)
1. 공발현 네트워크 분석(WGCNA): 유전자 간의 협동 발현 관계를 탐색하고 특정 표현형 또는 조건과 관련된 유전자 모듈을 식별하는 데 사용됩니다.
2. 가변 스플라이싱 분석: rMATS 등의 도구를 사용하여 가변 스플라이싱 분석을 수행하고, 다른 조건에서 스플라이싱 변이가 발생하는 유전자를 식별합니다.
3. SNP/INDEL 검출: 전사체에서도 SNP 및 INDEL 검출을 수행하여, 유전자 발현 또는 기능에 영향을 미칠 수 있는 변이 위치를 발견합니다.
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