펩타이드 맵 실험은 어떻게 하나요?

아래는 펩타이드 맵핑 실험의 기본 단계입니다:

1. 샘플 준비

• 단백질 추출: 적절한 추출 방법(예: 세포 용해, 초음파 파쇄 등)을 선택하여 샘플에서 목표 단백질을 추출합니다.
• 단백질 정제: 필요할 경우, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화 크로마토그래피 등의 방법을 사용하여 단백질을 정제합니다.

2. 단백질 효소 분해

• 효소 선택: 일반적으로 사용되는 단백질 효소로는 트립신(Trypsin), 키모트립신(Chymotrypsin), Lys-C 등이 있습니다.
• 효소 분해 조건: 효소의 특성에 따라 적절한 완충액과 조건(온도, pH 등)을 선택합니다. 일반적으로 37°C에서 몇 시간에서 하룻밤까지 배양합니다.

3. 펩타이드 분리

• 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC): 반대상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 효소 분해 산물을 분리합니다. 펩타이드의 극성과 크기에 따라 적절한 컬럼과 이동상을 선택하여 분리합니다.
• 그라디언트 용출: 일반적으로 물-아세토니트릴(또는 물-메탄올) 그라디언트를 사용하여 용출합니다. 이동상 A는 물+0.1% 삼플루오로아세트산(TFA), 이동상 B는 아세토니트릴+0.1% TFA입니다.

4. 펩타이드 검출

• 질량 분석: HPLC로 분리된 펩타이드를 질량 분석기를 사용하여 검출합니다.
• 데이터 분석: 질량 분석 데이터 분석 소프트웨어(예: Mascot, Proteome Discoverer)를 사용하여 펩타이드를 식별하고 매칭합니다.

5. 데이터 해석

• 펩타이드 맵핑: HPLC 및 질량 분석 데이터를 기반으로 펩타이드 맵을 작성하여 각 펩타이드의 유지 시간과 질량 스펙트럼 피크를 표시합니다.
• 비교 및 식별: 실험에서 생성된 펩타이드를 데이터베이스의 알려진 단백질 서열과 비교하여 단백질의 정체성과 효소 절단 위치를 확인합니다.
• 분석 및 검증: 펩타이드 맵 데이터를 비교하여 단백질의 구조와 수정 상태를 검증하고, 가능한 돌연변이와 번역 후 수정 등을 탐지합니다.

 

주의 사항

• 샘플 처리: 단백질 샘플의 순도와 농도가 효소 분해 및 후속 분석에 적합한지 확인합니다.
• 효소 분해 효율: 효율적이고 완전한 효소 분해를 보장하기 위해 효소 분해 조건을 최적화합니다.
• 데이터 품질: HPLC 및 질량 분석 데이터의 해상도와 감도를 보장하여 정확한 펩타이드 정보를 얻습니다.

 

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