단백질 포함체 문제를 어떻게 해결할까요?
단백질이 발현 과정에서 포함체를 형성하는 것은 흔한 현상이며, 특히 원핵 발현 시스템(예: 대장균)에서 자주 발생합니다. 단백질 포함체 문제를 해결하기 위한 전략으로는 발현 조건 최적화, 단백질 접힘 개선 및 재활성화 기술의 사용 등이 있습니다. 자세한 대응 방법은 다음과 같습니다:
1. 발현 조건 최적화
1. 유도 온도 낮추기: 발현 온도를 37°C에서 20–30°C로 낮추면 단백질 합성 속도가 느려져 잘못 접힘의 확률이 줄어듭니다. 더 낮은 온도는 가용성 단백질 발현에 도움이 됩니다.
2. 유도제 농도 줄이기: IPTG 등의 유도제를 사용할 때, 유도제의 농도를 낮춰 단백질 과도 발현을 줄임으로써 단백질의 가용성을 높일 수 있습니다.
3. 유도 시간 단축: 유도 시간을 줄이면 세포 내에 단백질이 과도하게 축적되는 것을 방지하여 포함체 형성 확률을 낮출 수 있습니다.
4. 약한 프로모터 사용: 약한 프로모터(예: pBAD 등)를 선택하면 단백질 발현 속도를 늦춰 단백질의 올바른 접힘 비율을 높일 수 있습니다.
2. 단백질 접힘 개선
1. 분자 샤페론 공동 발현: 분자 샤페론(예: GroEL/GroES, DnaK/DnaJ 등)은 단백질의 올바른 접힘을 도와 포함체의 형성을 줄입니다. 플라스미드에 분자 샤페론을 코딩하는 유전자를 추가하거나 발현 시스템에 외래 샤페론 단백질을 추가하면 단백질의 용해에 도움이 됩니다.
2. 융합 태그 사용: 가용성 태그(예: GST, MBP, SUMO 등)와 융합 발현을 통해 단백질의 용해성을 높일 수 있습니다. 이러한 태그는 단백질의 일부 구조를 유지해 응집을 방지하며, 발현 후에는 효소 절단을 통해 제거할 수 있습니다.
3. 번역 속도 최적화: 코돈을 변경하여 번역 속도를 조절하면 발현 시 잘못 접힘을 줄일 수 있습니다. 특히 대장균에서 인간 단백질을 발현할 때, 희귀 코돈의 최적화가 도움이 될 수 있습니다.
3. 재활성화 기술
단백질이 이미 포함체를 형성한 경우, 다음 단계를 통해 이를 재활성화할 수 있습니다:
1. 염 및 용매 제거 방법: 먼저 포함체에서 목표 단백질을 추출한 다음, 염을 서서히 제거하거나 용매 조건을 변경(예: 요소, 티오요소, SDS 등의 용해제를 사용)하여 단백질을 다시 용해시킵니다.
2. 접힘 보조 인자 추가: 용해 과정에서 금속 이온, 보조 효소 등 일부 접힘 보조 인자를 추가하여 단백질 접힘을 돕습니다.
3. 투석 접힘: 투석법을 사용하여 변성제를 서서히 제거하고 단백질의 접힘 구조를 점진적으로 회복시킵니다. 이는 단백질이 자연 상태로 복원되도록 접힘 과정을 세심하게 제어해야 합니다.
4. 발현 시스템 변경
포함체 문제가 해결되지 않는 경우, 다른 발현 시스템을 사용하는 것을 고려할 수 있습니다:
1. 효모 발현 시스템: 양조 효모 또는 분열 효모 등과 같은 진핵 발현 시스템은 더 나은 단백질 접힘 환경을 갖추고 있습니다.
2. 곤충 세포 시스템: 곤충 세포 발현 시스템(예: Sf9, Sf21 세포)은 더 복잡한 단백질을 올바르게 접힐 수 있습니다.
3. 포유류 세포 시스템: 단백질의 접힘 요구가 매우 높은 경우, 포유류 발현 시스템(예: HEK293, CHO 세포)은 자연에 가까운 접힘과 번역 수정을 제공합니다.
5. 화학적 또는 물리적 방법의 보조
1. 배지의 구성 조절: 삼투압 조절제(예: 솔비톨 또는 글리세롤)를 추가하면 세포가 더 나은 단백질 접힘 환경을 유지하는 데 도움이 됩니다.
2. 산화환원 환경 제어: 세포 내 산화환원 조건을 적절히 조절(예: 저농도의 DTT 또는 글루타티온 추가)하면 단백질이 올바르게 이황화 결합을 형성할 수 있습니다.
3. 소분자 접힘 보조제 추가: 아르기닌, 글리신, TMAO 등의 소분자는 발현 과정에서 단백질이 안정적인 구조를 유지하여 포함체 형성을 줄일 수 있습니다.
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